SPE固相萃取技術(shù)之固相萃取裝置的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
固相萃取的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
在什么項(xiàng)目的前處理適合使用固相萃取技術(shù)，即用固相萃取會(huì)比普通的溶劑萃取更理想，個(gè)人認(rèn)為有以下幾種情況：
（一）水中有機(jī)物的前處理。
此類常規(guī)處理基本上是用與水不相溶的有機(jī)溶劑振蕩萃取，用固相萃取的優(yōu)勢(shì)在于
（1）可以定量地重復(fù)前處理過(guò)程。
溶劑振蕩的操作一般只能要求到控制時(shí)間的程度，卻無(wú)法控制振蕩頻率，強(qiáng)度，動(dòng)作，我們知道，每個(gè)人的振蕩動(dòng)作是不同的，就是同一個(gè)人，也很難保證始終劃一的動(dòng)作。所以說(shuō)，溶液萃取的動(dòng)作是不定量，不能重復(fù)的。
而在應(yīng)用固相萃取時(shí)，比較容易保持過(guò)柱和洗脫速度的均一和穩(wěn)定，因此，固相萃取的萃取過(guò)程是可以重復(fù)，可定量的。
（2）現(xiàn)場(chǎng)處理。
水中有機(jī)物的分析有一個(gè)長(zhǎng)期困擾我們的瓶頸。即有機(jī)物在池塘水庫(kù)等環(huán)境中能保持相對(duì)穩(wěn)定，但是一旦進(jìn)入采樣瓶這個(gè)小環(huán)境中，就會(huì)迅速發(fā)生變化，所以很多水的有機(jī)物分析方法要求即采即分析，不能超過(guò)4個(gè)小時(shí)，可一般的情況是，從取水回到實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間就遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止4小時(shí)了，樣品發(fā)生了變化，分析結(jié)果的可靠性可想而知。
如果引入固相萃取技術(shù)，由于其設(shè)備簡(jiǎn)單，體積小，易于攜帶，*可以做到在現(xiàn)場(chǎng)一邊采樣，一邊進(jìn)行前處理。采樣者帶回實(shí)驗(yàn)室的是固相萃取柱，而不是水樣。這樣就能保證我們處理的是真正成份穩(wěn)定的水樣。
從實(shí)際應(yīng)用來(lái)說(shuō)，在水的檢測(cè)中用固相萃取技術(shù)取代傳統(tǒng)液液萃取還有相當(dāng)?shù)墓ぷ餍枰?，目前尚不?取代，但是其發(fā)展的前景很值得看好。
（3）有機(jī)試劑消耗量的減少。
在處理水樣時(shí)，如果用固相萃取，則只需要在洗脫時(shí)用到有機(jī)溶劑，用量比傳統(tǒng)液液萃取要少數(shù)十倍以上。對(duì)于實(shí)驗(yàn)者的人身保護(hù)和環(huán)境保護(hù)有著積極的意義。
二）批量生物材料的藥物成分萃取
這是固相萃取在實(shí)際應(yīng)用中比較成功的范例，主要是指在醫(yī)院中檢測(cè)血樣和尿樣時(shí)的前處理工作，由于對(duì)藥物成份的吸附是固相萃取的優(yōu)勢(shì)，加上樣品單一，組成固定，在確定方法后很適合大規(guī)模批量的凈化操作。
（三）免疫親和固相萃取。
萃取的理想狀態(tài)就是特異性富集或特異性排斥，可是不論是溶液萃取還是固相萃取，基本上是相似相溶的，zui多做到“某一類”層次上的萃取，而無(wú)法達(dá)到“某一種”層次的萃取。
在固相萃取柱的基礎(chǔ)上加上免疫親和技術(shù)，可以利用其生物特異性選擇吸附，能夠達(dá)到近于理論的完美萃取。
實(shí)際困難在于雖然其概念很好，但是由于技術(shù)難度相對(duì)較高，可供應(yīng)用的更少。
三、固相萃取的應(yīng)用局限性
（1）樣品局限性
固相萃取不適于處理固體樣品。對(duì)于固體，必須將其先制備為液體形態(tài)才能進(jìn)行固相萃取操作，這一點(diǎn)就遠(yuǎn)不如液體萃取了。
即使是液體樣品，固相萃取也有其額外的苛刻要求，即液體必須潔凈度高，不能有懸浮物或其它固體顆粒，否則會(huì)在柱前形成堵塞，無(wú)法繼續(xù)過(guò)柱及洗脫操作。所以固體樣品要制備成液體，液體樣品還要過(guò)濾。相比來(lái)說(shuō)，溶劑萃取就不存在這個(gè)麻煩，稍臟點(diǎn)也影響不大。
（2）結(jié)構(gòu)局限性
固相萃取柱的結(jié)構(gòu)很簡(jiǎn)單，除了塑料管，只有篩板和填料了。就這簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，帶來(lái)了便利，也帶來(lái)了與生俱來(lái)的矛盾，一些我們?cè)谟萌軇┹腿r(shí)永遠(yuǎn)不會(huì)遇到的矛盾。
矛盾1 液面的問(wèn)題。
當(dāng)我們進(jìn)行活化、凈化，洗脫等典型的固相萃取操作時(shí)，會(huì)使用不同溶劑，這時(shí)的操作要求在液面下降到篩板時(shí)換加不同溶劑，加得太晚，會(huì)使填料中干涸產(chǎn)生氣泡，影響結(jié)果的穩(wěn)定性（甚至?xí)驗(yàn)槿芤旱膹埩?wèn)題而使液面無(wú)法下降）。相反，如果加得太晚，會(huì)使加入溶液和在篩板上的原有溶液混合，產(chǎn)生一個(gè)其實(shí)是我們不希望存在的、無(wú)法預(yù)料極性的新洗脫液，使結(jié)果的可靠性大打折扣。
加液加到篩板，說(shuō)得容易做起來(lái)難，如果單獨(dú)做一個(gè)樣品可以緊盯液面操作。但是在批量操作時(shí)只會(huì)顧此失彼，固相萃取技術(shù)實(shí)用的一個(gè)重要意義就在于，其可以方便可靠地批量處理樣品，如果這個(gè)意義削弱的話，其實(shí)用性也就大大降低。
液面問(wèn)題是制約固相萃取應(yīng)用成功的主要瓶頸，雖隱蔽卻無(wú)法回避。
解決的方法有兩種。
第一種解決方法是干脆不用理會(huì)液面的困擾 ，每次都做到抽空溶液，這種做法倒是不會(huì)產(chǎn)生篩板上的溶液混合的問(wèn)題，但是又會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的問(wèn)題，即填料看起來(lái)是抽干了，但實(shí)際表面還是有數(shù)量不定的液體，每次干涸程度不一致，也無(wú)法重復(fù)。
另一種解決方法就是在使用固相萃取器時(shí)用電導(dǎo)探針測(cè)試，這個(gè)方法比較精確，但是也有一個(gè)新的問(wèn)題，探針需要一個(gè)清洗過(guò)程，否則會(huì)有交叉污染的可能，而且有這類裝置的固相萃取器價(jià)格一般相當(dāng)?shù)匕嘿F。且一個(gè)探針在同一時(shí)間只能探測(cè)一個(gè)樣品管，要同時(shí)監(jiān)測(cè)一批小柱則很困難。
矛盾2 填料的裝填松緊問(wèn)題。
用液體萃取時(shí)我們從來(lái)不用考慮整個(gè)溶劑的密度是否均勻，但是對(duì)于固體填料，我們卻不能忽略這個(gè)問(wèn)題。在同一批次甚至同一包里的幾個(gè)小柱，加上相同溶液時(shí)，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)液體過(guò)柱的速度是不均勻的 ，總是有快有慢。
由于生產(chǎn)工藝和成本的綜合考慮，固相萃取小柱不可能采用類似填充液相色譜柱的勻漿高壓法，所以填料的裝填松緊不均勻是必然的。這就造成一個(gè)問(wèn)題，由于液體流過(guò)的速度不一樣，在每次加液的時(shí)間也會(huì)不一樣，不利于同步批次處理樣品。而且回收率也會(huì)不同?？催^(guò)一些公司的所謂全自動(dòng)固相萃取器，其原理都有一個(gè)假設(shè)，即每根小柱的流過(guò)速度應(yīng)該一致，可惜，這真的是假設(shè)――“假”的“設(shè)”想。
矛盾3 填料的質(zhì)量穩(wěn)定問(wèn)題
在我們開啟一瓶二氯甲烷或丙酮時(shí)，只要買的不是偽劣產(chǎn)品，就是不同公司的也可以放心使用，因?yàn)樗鼈兊妮腿⌒阅苁欠€(wěn)定可靠的。而固相萃取則不同，就是同一公司的正品填料，每次的產(chǎn)品性質(zhì)還是有些許差異，不同公司的相差更大。而如果換一家公司的固相萃取柱或同一公司不同批次的小柱，都需要我們把所有的項(xiàng)目做一遍質(zhì)量評(píng)估，那估計(jì)也沒(méi)有太多人愿意使用。
矛盾4 不能加熱
一般的加熱行為可以改善吸附作用，可是由于固相萃取柱的套管是由塑料制造的，一加熱就會(huì)變形，所以只能做常溫操作。
3）項(xiàng)目局限性
從各家供應(yīng)商提供的資料來(lái)看，做得比較好的應(yīng)用主要在處理藥物方面，即分子量比較大，性質(zhì)比較穩(wěn)定的那些物質(zhì)。液體萃取的相似相溶理論已經(jīng)久經(jīng)考驗(yàn)，而固相萃取靠的是吸附與洗脫，已經(jīng)*不是經(jīng)典的萃取過(guò)程了，并不是所有的項(xiàng)目都適合用。很多經(jīng)典的液體萃取實(shí)驗(yàn)到現(xiàn)在也不能轉(zhuǎn)化到固相萃取，即使轉(zhuǎn)化，效果也不理想。
四、應(yīng)用固相萃取技術(shù)時(shí)的注意事項(xiàng)。
1.盡量慢。
我們?cè)谟霉滔噍腿r(shí)，面臨的一個(gè)問(wèn)題就是：液體應(yīng)該以什么速率過(guò)柱流出，我的經(jīng)驗(yàn)是，要想效果好，就要慢，盡量慢。
對(duì)于固相萃取柱中的填料，我們?nèi)绻植糠糯蟮乜?，能夠看到其?shí)它們是有很多的空隙，液體流通的渠道很多，如果流得快，相當(dāng)比例的待測(cè)組分還來(lái)不及與填料充分作用就地從通道流失；所以要慢，給它們一個(gè)充分作用的機(jī)會(huì)。
如何慢呢？一個(gè)竅門就是不要用配合抽氣機(jī)使用的所謂固相萃取器，而采用再普通不過(guò)的重力法。利用重力的作用使液體向下流出。在實(shí)驗(yàn)速度上，重力法遠(yuǎn)不如吸力法，但是在實(shí)驗(yàn)效果方面，重力法遠(yuǎn)比吸力法優(yōu)勝，用吸力法只能得到譜帶吸附，用重力法卻能得到柱頭吸附，在速度和效果兩者的平衡中，我們還是傾向于優(yōu)先保證好的效果。
舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)3ml 500mg的C18小柱，如果加甲醇活化，其甲醇全部流至篩板時(shí)間約為20分鐘，而在過(guò)樣品液時(shí)，25ml的液體zui多2小時(shí)可以流完，而且用重力法如果得當(dāng)，工作速率不一定比吸力法差很多。因?yàn)槲覀兛梢猿浞掷每臻e時(shí)間，用吸力法必須有人在旁邊守候，而重力法由于不需要用電，可以充分利用午休和晚上時(shí)間過(guò)柱，液體量大時(shí)接個(gè)堆疊接頭和延長(zhǎng)管即可，安排好實(shí)驗(yàn)步驟，工作效率一樣很高。另外，重力法不需要抽氣機(jī)和固相萃取器。
2.盡量少。
在固相萃取條件選擇上，有人為了提高提取效率，盡量多加液體，或選擇填料量大的小柱，我覺(jué)得大可不必如此。尤其在用重力法時(shí)，由于效率高，很多情況下是柱頭吸附，并不是所有的填料都在起作用，填料多了不僅液體流出速度會(huì)更慢，而且在洗脫時(shí)的擴(kuò)散會(huì)很明顯。
因此建議，夠用就行，在能保證效率時(shí)，填料盡量少，加液也不宜多。
3.實(shí)驗(yàn)條件不宜過(guò)分細(xì)化。
固相萃取從原理上是色譜分離，但是在操作時(shí)只把它作為吸附萃取劑使用，由于填料性質(zhì)、松緊常有差異，因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中不必因?yàn)樽非笮Ч?化而設(shè)計(jì)出很復(fù)雜的洗脫程序。
在建立條件中，我們應(yīng)該盡量多利用現(xiàn)成的資料，盡快地建立起體系，同時(shí)要對(duì)操作過(guò)于復(fù)雜的步驟保持警惕性，在實(shí)驗(yàn)效果，實(shí)驗(yàn)速率和易操作性三者中取得平衡點(diǎn)。
4.只用一次
固相萃取柱只用一次。因?yàn)閺膰?yán)格的意義上來(lái)說(shuō)，很多物質(zhì)的吸附是不可逆的，一次吸附，無(wú)法洗脫，影響著下一次吸附，雖然有人做過(guò)重復(fù)利用的實(shí)驗(yàn)，但是總體來(lái)說(shuō)為了節(jié)省一點(diǎn)經(jīng)費(fèi)而大大增加了結(jié)果的不可靠性和不確定性，是很不合算的行為。
因此建議，只用一次。如果想節(jié)省經(jīng)費(fèi)可以從減少填料量和使用小容積管入手，盡量用堆疊接頭和延長(zhǎng)管。
5.慎用固相萃取器
所有的供應(yīng)商都會(huì)在推薦固相萃取柱的同時(shí)，推薦固相萃取器，zui簡(jiǎn)單的固相萃取器也要幾千，如果貼個(gè)進(jìn)口商標(biāo)價(jià)格更要加幾倍，這樣的價(jià)格還不包括抽氣機(jī)。但是這樣的配置就是再加上調(diào)速開關(guān)，也很難得到好的結(jié)果，主要問(wèn)題就是把小柱的不平行性放大了。
建議：實(shí)在不適合重力法的才用固相萃取器。
至于全自動(dòng)固相萃取器，應(yīng)該說(shuō)，現(xiàn)在市面上還沒(méi)有比較理想、適合食品檢測(cè)的機(jī)器，主要問(wèn)題就是無(wú)法解決一批小柱中液面下降不一致的問(wèn)題，加上價(jià)格很昂貴，性價(jià)比也自然不高。帶液面測(cè)量的也不能對(duì)多批量的小柱同時(shí)檢測(cè)，且有交叉污染的危險(xiǎn)。
目前的全自動(dòng)固相萃取器基本上是走重力法路線，倒是回避了密封的難題。
6.不可忽視傳統(tǒng)的液體萃取 。
有些人在初次接觸固相萃取時(shí)，總覺(jué)得它能取代液體萃取，實(shí)際上就象毛細(xì)管電泳無(wú)法取代液相色譜一樣。固相萃取在某些場(chǎng)合比液體萃取合適，但是在更多情況下，還是傳統(tǒng)的液體萃取更可靠更合適。這一點(diǎn)從目前實(shí)驗(yàn)技術(shù)的實(shí)際發(fā)展可以得到印證。
關(guān)于液固萃取，我們不要僅僅把它看作是一個(gè)提取過(guò)程，從另一個(gè)角度來(lái)看，它還 是一個(gè)凈化過(guò)程，是把固形干擾物排除凈化的過(guò)程。理解這一點(diǎn)，有助于我們優(yōu)化選擇實(shí)驗(yàn)方法。
7.實(shí)用性是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成功與否的重要部分
在設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，開始要考慮到其技術(shù)上是否先進(jìn)。而在實(shí)際運(yùn)用中，決定這個(gè)方法是否可行，是否能夠存在的關(guān)鍵是實(shí)用性。一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法不僅要解決問(wèn)題，而且能夠在人力，物力，財(cái)力三方面達(dá)到平衡，且滿足可持續(xù)、可重復(fù)操作的要求。
因此，再先進(jìn)的技術(shù)，也要服從實(shí)用性，否則就沒(méi)有生命力。
五.舉例點(diǎn)評(píng)2003版新國(guó)標(biāo)的固相萃取技術(shù)運(yùn)用。
2003版的“食品衛(wèi)生檢測(cè)方法 理化部分”的色譜實(shí)驗(yàn)部分，相對(duì)于1996年的版本，它引入了一些新的技術(shù)，主要是普遍采用了儀器法。進(jìn)步雖然明顯，可錯(cuò)誤依然很多，有些甚至是一脈相承。尤其是某些新引入的國(guó)標(biāo)，只能讓人無(wú)比感慨標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)機(jī)構(gòu)的寬容與勇敢。
雖然在2003版國(guó)標(biāo)中大范圍地引入了固相萃取技術(shù)，但是如果直接套用書中的方法，其實(shí)用性相當(dāng)?shù)?。下面以農(nóng)藥檢測(cè)中（詳見(jiàn)表1 ）常用的佛羅里硅土舉例，講解新國(guó)標(biāo)應(yīng)用固相萃取技術(shù)的主要問(wèn)題和解決方法。
新國(guó)標(biāo)中對(duì)于佛羅里硅土的處理從頭到尾如出一轍：“在650℃下活化4－5小時(shí)，臨用前用3％的水去活化。再取一支玻璃層析管，上下各裝1.5厘米高的無(wú)水硫酸鈉，中間加入10克處理后的佛羅里硅土”，都是淋洗和濃縮的步驟。
以上的步驟看起來(lái)很清晰，但是可操作性卻很差，具體分析成以下幾個(gè)方面。
（1）“在650℃下活化4－5小時(shí)”。 高溫活化的過(guò)程雖然是5 個(gè)小時(shí)，但是馬弗爐從650℃降到室溫就需要10小時(shí)以上，所認(rèn)光活化就是一整天的時(shí)間。
（2）“臨用前用3％的水去活化”。由于處理后的佛羅里硅土吸附性太強(qiáng)，所以要加入水來(lái)滅活，3％的概念是指按照佛羅里硅土重量的3％加入水量，但是誰(shuí)也無(wú)法保證加入的水是均勻的，這是一個(gè)結(jié)果平行的隱患。
（3）“裝入玻璃層析管”，應(yīng)該注意到這是一個(gè)在實(shí)驗(yàn)前才能做的工作，而不能將材料做好后儲(chǔ)備起來(lái)。
（4）“淋洗和濃縮”，這是實(shí)用性差的階段。一般的淋洗后體積為100ml，而濃縮后的體積要求一般在2ml左右。這樣就需要用到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，而我們知道，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的工作效率是很低的。
從以上4 點(diǎn)可以看到，這一系列操作的問(wèn)題在于所有的材料均要在臨實(shí)驗(yàn)前手工裝備完成，而且還要經(jīng)過(guò)耗時(shí)耗力的濃縮過(guò)程。如果這是在一個(gè)科研機(jī)構(gòu)開發(fā)方法，或一天只處理一個(gè)樣品則是勉強(qiáng)可行，但是對(duì)于我們這樣的基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)則是*不現(xiàn)實(shí)的。
要解決以上的問(wèn)題，方法就是先要利用現(xiàn)成的、可長(zhǎng)期保存的商品柱代替手工裝填柱，其次要盡量避免大體積的濃縮過(guò)程。
商品的佛羅里硅土柱各家公司均有售，個(gè)人推薦使用的規(guī)格為3ml，500mg，至于品牌選擇，一定要買大公司的獨(dú)立包裝柱。我曾經(jīng)買過(guò)一小品牌的效果很差。佛羅里硅土的填料其實(shí)很普通，關(guān)鍵在于廠家在制造前是否經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的燒烤過(guò)程。
由于使用商品柱，所以加3％的水去活化變成一件不可能的事情，但是據(jù)我的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，*可以利用樣品本身去活化，所以這一步驟是可以去除的。
至于“淋洗和濃縮”步驟，我建議不一定要非全部洗脫出來(lái)再濃縮定容才能保證準(zhǔn)確的值，在淋洗曲線的某一點(diǎn)，洗脫出的溶液濃度會(huì)正好與實(shí)際樣品液濃度會(huì)一致，只要能控制在某一點(diǎn)的洗脫液接收，*可以避免復(fù)雜的濃縮過(guò)程，這一點(diǎn)，對(duì)于那些本身就對(duì)熱不穩(wěn)定的項(xiàng)目是更加重要。
例如GB/T 5009.146-2003“植物性儀器中有機(jī)氯和擬chu蟲ju酯類農(nóng)藥多種殘留的測(cè)定”，要求在手工填裝的佛羅里硅土柱加入2 ml石油醚試液，再用100ml石油醚+乙酸乙酯（95+5）后洗脫，后將100ml濃縮至1ml后測(cè)定。而通過(guò)上述所提的淋洗曲線，會(huì)發(fā)現(xiàn)2ml淋洗液是無(wú)待測(cè)物洗脫，第2－3ml是比實(shí)際值高一倍的洗脫液，第3－5ml的洗脫液則與實(shí)際樣液濃度一致，所以可以直接取第3－5ml的洗脫液測(cè)定，而不用經(jīng)過(guò)一個(gè)全部洗脫后再濃縮的過(guò)程。
這樣，我們就可以提出以下的“實(shí)用版”植物性食品中有機(jī)氯和擬chu蟲ju酯類的前處理步驟：
1.取干燥樣品5.0克于250ml碘量瓶中，加石油醚50ml，放在振蕩機(jī)上振蕩30 分鐘。（如果是含水分樣品，則先加入適量無(wú)水硫酸鈉混合，等其脫水后再同上處理）。
2.用三角漏斗過(guò)濾，收集濾液（濾液可輕度濃縮）。固定豎立凈化柱，凈化柱上接堆疊接頭，上接24ml空管。
3.加全部濾液進(jìn)入空管內(nèi)，過(guò)柱。
4.等濾液全部從柱底端流完后，加入3ml石油醚+乙酸乙酯（95+5），洗脫液放棄，整個(gè)過(guò)程小柱加蓋，防止揮發(fā)。
5.第一次加入的洗脫液流完后，再加入3ml石油醚+乙酸乙酯（95+5），在小柱底端收集洗脫液）
6.進(jìn)樣。
表1 從“食品衛(wèi)生檢測(cè)方法 理化部分(二)”中農(nóng)藥項(xiàng)目部分摘錄的表格
頁(yè)數(shù) 項(xiàng)目名稱 填料種類
47 氯氰菊酯 三氧化二鋁
75 三環(huán)唑 三氧化二鋁
364 丁草胺 三氧化二鋁
341 有機(jī)磷多組份 凝膠滲透(GPC)
347 有機(jī)氯和擬除蟲菊酯 凝膠滲透(GPC)
359 氨基甲酸酯 凝膠滲透(GPC)
23 百菌清 佛羅里硅土
29 二氯苯醚菊酯 佛羅里硅土
41 水胺硫磷 佛羅里硅土
59 喹硫磷 佛羅里硅土
127 三唑酮 佛羅里硅土
145 佛磺胺草醚 佛羅里硅土
155 莠去津 佛羅里硅土
161 綠麥隆 佛羅里硅土
166 禾草敵 佛羅里硅土
173 滅幼脲 佛羅里硅土
179 五氯硝基苯 佛羅里硅土
217 吡佛禾草靈 佛羅里硅土
230 甲ji異柳磷 佛羅里硅土
239 有機(jī)氯和擬除蟲菊酯 佛羅里硅土
247 除蟲脲 佛羅里硅土
297 稻瘟靈 佛羅里硅土
369 2,4-滴丁酯 佛羅里硅土
420 佛樂(lè)靈 佛羅里硅土
427 噻螨酮 佛羅里硅土
431 異丙甲草胺 佛羅里硅土
437 2,4-滴 佛羅里硅土
447 敵稗 佛羅里硅土
465 惡草酮 佛羅里硅土
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